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        檢測癌癥組織中的基因融合和堿基突變新技術!RNA+DNA同時測序

        http://www.b2b.hc360.com 中國金屬加工網 信息來源:Author發布時間:2019年12月16日瀏覽:506

        12月11日消息,近日,由浙江省腫瘤醫院牽頭,恒特基因等國內多家單位共同合作完成的一項研究發表在醫學實驗技術領域核心期刊Clinical Chemistry上,題目為“Simultaneous Detection of Gene Fusions and Base Mutations in Cancer Tissue Biopsies by Sequencing Dual Nucleic Acid Templates in Unified Reaction”。作者們報道了一種整合的NGS檢測方法,能夠檢測報告出從組織樣本中提取的總核酸(TNA)中的多種變異類型,并極大地簡化了變異檢測流程。

        檢測癌癥組織中的基因融合和堿基突變新技術!RNA+DNA同時測序

        研究者們開發了稱為平行擴增數字優化測序(PANO-Seq)的檢測方法,能夠將組織樣本中提取的總核酸(TNA)直接轉化為一個NGS文庫,而無需在實驗操作過程中將基因組DNA(gDNA)和RNA分別建庫。利用PANO-Seq,他們從66例新鮮的肺癌組織切片樣本的預隊列中檢測到的突變有:EGFR(27例),KRAS(4例),PIK3CA(4例),BRAF和細胞周期依賴性激酶抑制基因(CDKN2A)(各1例)。此外,還鑒定到3例融合變異,包括2例EML4-ALK融合和1例驅動蛋白家族成員5B-轉染期間重排激酶(KIF5B-RET)融合,證明了一次同時檢測多種變異類型和雙模板檢測的目標是切實可行的。

        檢測癌癥組織中的基因融合和堿基突變新技術!RNA+DNA同時測序

        圖1. 在單個反應管中用一個統一的方法同時對 DNA和RNA進行測序

        后續大樣本量研究中,研究人員收集了1095例患者的FFPE樣本,這些樣本的年限從小于1年到大于5年不等。本隊列涵蓋肺癌已知的各種亞型,包括815例腺癌(74.4%),183例鱗狀細胞癌(16.7%)和97例其他類型或未分類的病例(8.9%)。用于檢測的靶向重測Panel含有179個擴增子,覆蓋了10個基因的32個外顯子和啟動子(基于DNA檢測點突變和插入缺失),基于RNA檢測14個基因的融合變異,同時覆蓋了3個基因的12個內含子,使得RNA質量差的樣本可通過DNA模板來檢測融合。

        結果顯示,成功測序及分析的文庫,上靶率為60.1%,除重后平均測序深度12622,70%以上目標區域測序深度達到0.2倍平均測序深度以上。小于50bp的擴增子(模板完整性的指標)占比為48.9%。對培養的細胞系樣本與FFPE樣本的分析結果進行對比,發現細胞系樣本模板完整性顯著高于FFPE樣本,表明這些實際樣本表現很大程度上受臨床樣本質量影響。值得注意的是,可通過調節引物池中相關引物的濃度方便地優化檢測的均一性,表明這一檢測平臺是十分靈活的。

        相較于DNA,RNA不穩定易降解,因此在NGS測序之前對樣本的質量進行系統評估是非常重要的。然而,傳統的核酸定量檢測方法,可能無法準確測定核酸模板的質量或區分RNA和DNA。研究人員開發了pre-NGS qRT-PCR 的質控方法,用來評估雙RNA/DNA模板的質量,并分析所有可獲得的組織樣本,證明其是一種在NGS工作流程中比傳統方法更高效的檢測方法。

        檢測癌癥組織中的基因融合和堿基突變新技術!RNA+DNA同時測序

        圖2. RNA質量分析和二代測序上機前的評估檢測

        以高于FFPE樣本基線的5%MAF作為截斷值,研究人員發現,所有患者中有834例攜帶有至少一個突變??傮w上,DNA測序數據達到可接受的質控要求的患者中,有79%(739/935)攜帶一個相關突變事件,且45%(421/935)位于熱點區域。進一步,研究者們將檢測到的每一種突變類型,至少取1例樣本使用Sanger測序法單獨檢測,用于確證本檢測的結果的正確性。對32例作為最常見的突變類型代表的EGFR_L858R病例和20例陰性的樣本進一步進行驗證,結果證實了所有結果均完全一致。

        所有患者中,有69例為融合陽性;在RNA測序數據達到可接受的質控要求的亞組中融合陽性率為7.7%(58/754)。其中ALK、ROS1、RET這三個基因的融合占了絕大多數的融合事件。另外還檢測到6例MET 14號外顯子跳讀,1例HLA II類分子的組織相容性抗原DRB1的β鏈與MET發生的融合(HLA-DRB1-MET,這一融合之前僅被報道過一次),以及BRAF(BBS9-BRAF和AGK-BRAF) 和神經調節蛋白1 (NRG1) (CD74-NRG1和MKL2-NRG1)四例融合事件。在這一隊列中另檢出了多個NTRK1融合病例將另案報道。

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        圖3. 融合及熱點突變信息匯總

        此外,34例融合陽性的病例中,每種融合類型至少有1例代表性病例以及最常見的基因間ALK融合和MET 14號外顯子跳讀的所有病例,得到了Sanger測序的確證。29例陰性的樣本也進行了ALK的檢查,結果均為ALK陰性。因此,本檢測方法能夠準確且有效的檢測出已知及新穎的融合變異事件,同時還能夠并行檢測其他部分的遺傳變異。

        該研究代表了一種努力方向,即開發一種具有廣泛包容性的檢測方法,可同時測定核心的可治療靶點及罕見但有效的融合變異事件,并能夠對很大一部分肺癌(及其他)患者的治療產生潛在影響。這一方法不僅有益于大部分的攜帶核心可治療靶標的患者,也給那些攜帶有罕見變異的患者帶來獲益。未來,研究人員將進一步擴展這一分析方法,使其能夠檢測靶基因的RNA表達和DNA拷貝數特征如PD-L1,為免疫檢查點抑制劑的治療提供額外的生物標志物信息。

        背景

        靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療目前已顯著改善了腫瘤患者的生存率,而新型療法的有效運用往往需要依賴于對基因變異的準確檢測。當前的研究表明,諸如NTRK(神經營養因子受體酪氨酸激酶)等罕見的融合變異事件能有效地驅動腫瘤發生,并成為多種腫瘤中靶向治療的靶標?;贒NA檢測的大Panel可以覆蓋幾百個癌基因,是大規模探測突變的強有力工具,但在融合/重排檢測方面仍具有一定挑戰。靶向二代測序是一種能夠綜合鑒定癌癥生物標志的方法,根據不同的變化情況,起始的檢測材料可為DNA或 RNA,但分別進行兩次檢測會增加工作負擔且常常不可實現,進而延誤或完全沒有檢測到關鍵變異事件,特別是那些有效的可靶向治療的融合事件。故單次檢測中通過精簡的程序即可同時分析兩種模板(DNA和RNA)是實際工作中的迫切需求。

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